KRAS 변이는 고형종양에서 흔하게 나타나는 유전자 변이로 변이 발생률이 췌장암에서는 90%가 넘고, 전이성 대장암에서는 40%, 폐선암에 서도 30% 이상이다. KRAS 변이가 없는 대장암에 대해 Erbitux® (cetuximab)나 Vectibix® (panitumumab)가 승인되었고 FFPE 조직 IVD검사는 이미 승인되어 사용되고 있다. 비소세포폐암에서 Osimertinib (상품명 Tagrisso, AstraZeneca) 약제 사용 조건으로 Roche cobas EGFR mutation test v2 혈액 검사결과가 인정되면서, 국내외에서 액체 생검(liquid biopsy)이라 불리는 혈중 CNA (circulating nucleic acid) 검사가 진료에 처음 쓰이게 되었지만, 아직 표적 치료제가 없는 KRAS 변이의 경우, 혈액 검사는 LSR (life science research) 시약으로만 시행되고 있다. 수십 년간 시도해왔던 KRAS 억제제 개발의 성과로 작년 말 G12C 억제제 MRT X849의 임상 1상 결과가 발표되고, 범용 KRAS 억제제 전임상 데이터도 공개되어 기대를 모으고 있다. 본원에서는 비소세포폐암 환자에 대한 EGFR 유전자 돌연변이 검사를 Roche 사의 cobas z480 analyser와 EGFR mutation v2 시약을 사용하여 시행하던 중 대장암 환자에서 혈장 ctDNA 검사를 포함한 연구를 진행하게 되었고 기존 시스템을 사용한 KRAS mutation test v2(LSR)를 사용해보게 되었다.

기존에 검사하던 EGFR과 추출과 분석 과정이 거의 동일하지만, 검사 결과가 진료로 직결되는 IVD시약과 달리 연구용 검사 시약 LSR이라 검사 결과를 세부적으로 참고할 수 있도록 channel 별 Ct값을 볼 수 있었다. 3개의 마스터 믹스(MMX) 튜브의 결과를 종합해서 판단하고 각 변이별로 Ct값의 결정치(cutoff)가 다르고 그 정보가 공개되지 않는 것이 다른 real-time PCR과 달라서 약간 혼란스러웠지만 LSR 시약임에도 Roche Korea 학술부를 통해 친절하게 설명을 들을 수 있었다. 정량을 알고 있는 결과와 Roche 시스템에서 매칭하여 구한 최대 Mutation positive Ct 값에 1을 더하고 이번 검사 결과의 Ct 값을 빼서 SQI (Semi-Quantitative Index) 수치를 제시하는 계산도 EGFR과 동일하였다. 식 1. 참고 Roche 홈페이지에 data를 loading 하여 분석하거나 software를 통해서 고유의 algorithm을 이용하여 MMX마다 들어 있는 internal control을 통해 DNA의 quality와 증폭의 안정성을 점검하고 각 변이의 양성과 음성을 판정하는 시스템이었다. 다만, 그럼에도 불구하고, cobas 추출 시약을 사용하는 경우 NGS와 달리 검체의 QC를 별도로 진행하지 않기 때문에, 본 검사만으로는 혈액 cfDNA 내에 ctDNA가 존재하는지 유무를 증명할 수 없어 아쉬웠다. 그래서 차후 EGFR처럼 진료용 검사를 시행하게 된다면 혈장 기반 정도관리물질을 별도로 구매해 LoD 검증을 수행하고 시작하고, lot 별로 되도록 많은 변이를 포함한 양성 환자 검체로 동등성 비교를 진행하며 관리하는 것이 보다 신빙성이 높을 것 같다.

EGFR mutation test v2에서 그렇듯 KRAS mutation test v2도 exon 2, 3, 4에서 28개 변이를 6개 그룹으로 보고하는데 G12C로 구체적으로 보고되어야 할지는 동반 진단 여부를 지켜보아야 하겠다. 연구용 검체 중 혈장이 부족하여 권장량 2mL의 25%인 500uL로 진행한 6개 검체 중 1개 검체만 invalid 결과를 얻었을 뿐 안정적인 SQI 값으로 검출되며 환자 조직 결과나 같은 혈장으로 평균 x1000 depth로 시행한 NGS 결과와 모두 일치하여 결과의 민감도에 신뢰를 가질 수 있게 되었다. EGFR처럼 invalid인 경우 error 코드가 나오기 때문에 internal control이나 결과가 허용범위를 벗어난 사유를 추정해서 사례별로 희석이나 pellet 재검을 시도할 수 있어 소량의 검체로 CNA 연구를 시행할 때 유용하였다. 아직 연구 결과는 나오지 않았지만 cobas KRAS mutation test v2 사용 경험을 통해 (직접적인 sample 추출에 대한 QC가 불가능한 시스템으로 시행하는) 과내 CNA 검사에 대해서 보다 깊이 있는 이해를 할 수 있게 되었다. 해당 시스템으로 임상 검사가 지속된다면 국내 외부정도관리를 통해 SQI 값을 비교하거나 기본적인 QC 이외의 정도 관리를 수행하기 위한 구체적인 방법이 제시되면 더 좋을 것 같다.